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明细胞壁上的糖链和细胞外的粘多糖具有金属吸附的活性不同的金属离子被不同的多糖吸附可以提高细胞抗重金属的能力。第二阶段是指微生物累积这一主动过程它仅发生在活细胞内。当活细胞生存在环境中时它可以通过多种机理包括运输以及细胞内外的吸附来“提高”本身的金属含量。已提出的金属运送的机制有脂类过度氧化、复合物渗透、载体协助、离子泵等。微生物累积过程是通过微生物的新陈代谢伴随着能量的消耗进行的它比微生物吸着慢得多。
关于微生物吸着这一相对简单的过程在此不做过多的讲述而微生物累积目前来看已在生产中应用很多而且收到了良好的效果。它是指重金属进入细胞后通过“区域化作用”分布在细胞内的不同部位被封闭为低毒的形式。近年来这方面研究最多的是重金属硫蛋白MT这种蛋白质中的巯基可以和重金属离子形成稳定的复合物沉积下来。
金属硫蛋白是1957年Margoshe和Vallee在研究镉的生化功能时发现的它是一种低分子量、富含半胱氨酸但不含芳香族氨基酸和组氨酸的金属结合蛋白广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中并且能够在胁迫条件下诱导产生。金属离子通过和MT中半胱氨酸的巯基结合形成生物学上稳定的形式沉积下来。 目前的研究认为镉可以直接作用于MT基因的启动子诱导MT mRNA的大量表达诱导合成的金属硫蛋白一方面可以螯合一定量的镉形成Cd-MT复合物以降低细胞内的镉浓度另一方面通过自身巯基氧化态/还原态的转换来清除由镉诱发产生的自由基从而减轻镉对生物体的损伤。根据半胱氨酸的含量和结构MT可分为三类即Ⅰ 、 Ⅱ、Ⅲ类前两类是直接的基因产物第Ⅲ类是非翻译的富含半胱氨酸的分子命名为重金属螯合肽其中Ⅰ类MT的Cys排列在N-端和C-端均为Cys-Xaa-Cys X为任何其他氨基酸残基 Ⅱ类MT在N-端为Cys-Cys、 Cys-Xaa-Xaa-Cys或Cys-Xaa-Cys的排列在C端为Cys-Xaa-Cys的排列。
随着分子生物学研究手段的发展采用人工合成物对重金属进行吸附已经成为一种快速、有效的方法。它是基于细菌表面展示系统原理用基因重组的方法将外源性多肽或蛋白与细菌表面的蛋白(如外膜蛋白、鞭毛蛋白)融合 以正确的构象和方向插入并停留在细菌外膜功能性地表达在细菌表面。借助于细胞表面展示技术可以将具有络合重金属功能的外源蛋白与LamB、 OmpA、 PhoE等结构相似、均以一系列β折叠跨膜的外膜蛋白结合这类外膜蛋白中裸露于细胞外的肽段形成的环以夹心方式插入外源性序列这样形成的结构不影响蛋白质的总体构型但能功能性地表达外源蛋白。已发现人工合成Hexa-His能插入信号序列N-末端和a-凝集素序列一半的C-末端之间使合成产物表达于细胞表面 从而提高吸附重金属的能力。
1.2重金属的转化作用
微生物能通过氧化还原、甲基化和去甲基化作用转化重金属将有毒物质转化成无毒或低毒物质。其中微生物对汞的转化作用最常见且研究得最清楚它主要有两种作用方式汞的甲基化和将Hg2还原为Hg0。
甲基汞的脂溶性高易和蛋白质中的巯基结合其毒性是无机汞的100倍但甲基汞易于挥发因此推测微生物合成甲基汞是一种解毒机制。甲基钴胺素是能转移负碳离子的甲基基团被公认为在汞甲基化时提供甲基供体但目前还不清楚甲基化是酶促过程还是非酶促
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过程本文暂且将其归入代谢类型。
微生物通过有机汞裂解酶催化有机汞的碳汞键断裂再由依赖NADPH和FAD为辅酶的二聚体酶汞还原酶把无机Hg2还原为Hg0使之挥发离开菌体细胞这一过程是可诱导的有机汞裂解酶和汞还原酶的底物都是其酶的诱导剂。研究表明与运输汞有关的基因有MerA、MerB、MerC、MerD、MerP、MerR和MerT它们位于同一个操纵子上。其中MerA编码汞还原酶该酶常以二聚体形式在细胞质内与内膜呈松疏的结合MerB编码有机汞裂解酶但它的定位尚未确定MerT和MerC编码有关Hg2吸收的内膜蛋白MerR编码调节蛋白MerP编码位于周质空间结合Hg2的蛋白MerD是革兰氏阴性菌中除MerR之外的第二个调节基因它们均编码调节蛋白结合于操纵子的OP处来调节mer操纵子上的结构基因。当无Hg2存在时调节蛋白结合于操纵子的OP处阻止RNA聚合酶与DNA结合。当Hg2存在时 Hg2与MerR蛋白结合但Hg2和MerR蛋白的复合物并不离开DNA而是在OP处使DNA发生扭曲、折叠使RNA聚合酶与DNA结合激活MerT、MerP、MerC、MerA、MerB转录前三个蛋白组成Hg2吸收、转运系统将Hg2运至MerA作用部位从而高效、快速地将Hg2还原成Hg0 降低Hg2对细胞的毒性。
1.3输出系统对重金属的作用
某些二价金属离子由于没有足够的还原酶所需的NADPH又缺乏甲基化或其他共价修饰机制 因此不能像Hg0那样挥发出细胞但可以借助于输出系统完成这一任务其中有三种系统RND、 CDF和P-ATPase介导二价金属阳离子排出细胞 目前这种输出机制主要用于抗镉和抗铜系统。
在细菌中发现两种不同的抗镉系统一种是在金黄色葡萄球菌中发现的革兰氏阳性菌对Cd2和Zn2外排的cadCA阳离子输出系统它是一种P-ATPase通过水解ATP提供能量将重金属离子泵出细胞这种运输系统比较简单在此不做赘述。另一种是在产碱杆菌pMOL30质粒上发现的革兰氏阴性菌对Cd2、 Zn2、 、 Co2输出的czc系统 czc系统编码RND驱动的跨膜输出子CzcCBA和CDF型的CzcD 其中CzcCBA由CzcA、 CzcB和CzcC组成,CzcA是位于细胞质膜的质子-阳离子反向运输子 CzcB是位于周质空间的膜融合蛋白 CzcC则位于细胞外膜它带有前导序列它的原肽在跨过细胞质膜的过程中被加工成熟CzcD对CzcCBA的表达起到调节的作用。从上可以看出这两个系统除了都输出Cd2外在输出机制、底物专一性组成特点等方面都有很大的差异。
目前细菌中有两种不同质粒控制的抗铜系统研究得比较清楚。一种是在丁香假单胞菌中发现的cop系统另一种是在大肠杆菌中发现的pco系统。丁香假单胞菌的cop系统中copA和copB行使部分抗铜活性当copC和copD存在时才能行使全部的抗铜活性。CopA和copC是周质空间蛋白 copB是外膜蛋白 copD蛋白的功能和定位尚不清楚。 Cop的抗铜机制是Cu2在周质空间被copA和copC结合在细胞质中Cu2被封闭从而使细胞质中游离的Cu2浓度受到控制 Cop系统的调节由copR和copI实现。大肠杆菌中铜的抗性非常特殊 由质粒编码的蛋白因子和染色体编码的蛋白因子共同完成对Cu2的转运、胞内结合和排放调控。 CutA和CutB是染色体编码的Cu2吸收系统染色体编码的CutE和CutF在细胞内参与Cu2的结合染色体基因编码的CutC和CutD负责Cu2的排放 CutR负责整个操纵子的调节。在正常的生
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理调节下染色体上的Cut操纵子负责Cu2的转运和保持在Cu2过量的情况下质粒上pco操纵子开始转录其上有pcoA、 pcoB、 pcoR和pcoC四个基因蛋白质序列分析可知pcoR是典型的磷酸转移两组分调节系统的传感器蛋白因为质粒上无相应的编码反应调节器蛋白的基因所以推测可能在染色体上。 Cu2过量时 PocC结合胞内的Cu2通过pcoA和pcoB与pcoC和pcoD构成四组分排放系统将Cu2排出胞外。
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